组织透明技术总结帖(2)——透明方法分类和比较

这篇文章也基本是翻译文献为主,主要参考的是Clarifying Tissue ClearingA beginner’s guide to tissue clearing这两篇。

根据透明原理,我们整理出了四条组织透明的思路,也可以用这几个思路去将透明的方法分为四大类,基于有机溶剂法(Solvent based clearing)、简单浸入法(Simple immersion)、超水合法(Hyperhydration),和水凝胶包埋法。

先介绍第一个方法,有机溶剂法。这个方法就是先用有机溶剂如(四氢呋喃(THF)脱水,经过第一阶段的脱水后,组织里的水分子和一部分脂质分子被去除了,剩下的以蛋白质为主要成分,所以它的折射率会达到1.5以上的水平。所以下一步就要用折射率高于1.5的,同时有良好脂溶性的溶剂去进一步脱脂和脱水,比较常用的是水杨酸甲酯,苯甲醇,苯甲酸苄酯等溶剂(注意,大部分溶剂都有芳香环)。

这一类的方法有BABB,3DISCO,iDISCO等。这种方法的优点是透明的效果比较可靠,速度也相对较快。它的主要问题在,因为需要用有机溶剂脱水,而大部分的荧光蛋白发光需要水分子,所以会在很短的时间内发生淬灭。FluoClearBABB,uDISCO法对此进行了改进,可以将荧光保存数月。除了这个缺陷,因为大量脱水,它还会引起样品的大幅度收缩(在iDISCO+中有改进);因为溶剂通常由毒性,它需要特殊物镜来避免溶剂对它的腐蚀破坏等。这个方法应用在分析血液系统和肿瘤中的药物递送(BABB法),在细胞水平绘制小鼠大脑活动的图谱(iDISCO+)等。

第二个方法是简单浸入法。这个方法就是将样品放入高折射率(1.44-1.54)的溶液中,让它整体达到一个高的折射率水平。最初采用的溶剂有蔗糖、果糖、甘油、甲酰胺等,但是这些溶液黏度过高,导致容易在室温下沉淀和产生气泡等一系列问题而逐渐被淘汰。人们转向低黏度的溶剂。这里要介绍的是用重氮酸(Hypaque™)作为溶剂的FocusClear™,和用碘海醇(Histodenz™)作为溶剂的RIMs。这两个溶剂都带有芳香环和三个碘原子,所以能提供大量电子,这些电子会和光子相互作用形成高的折射率。但是,这些溶剂的成本非常昂贵,就碘海醇来说,100g要2000-3000RMB的价格。有没有成本更低的方案呢?也是有的。便宜且有效的溶剂有TDE技术和FRUIT技术。顾名思义,TDE使用了2,2′-硫代二乙醇(TDE)作为溶剂。这种溶剂可以用作超分辨率显微镜的安装介质,也可以用作组织透明,但是,在高浓度下,它会降低荧光集团的发光亮度。FRUIT是用尿素和果糖混合在一起,从而降低SeeDB果糖溶液(一种简单浸入的透明方法)的黏度,并且增强渗透能力和透明能力。简单浸入法的好处就是成本低廉,且步骤简单,可以保留脂质。但是它透明的速度比较慢,而且对大样品来说,透明的效果并不好。所以它被应用作透明小样本,比如说100μm的神经球成像(ClearT2),100μm的神经元的超分辨率成像(SeeDB2)。

第三种方法是超水合法。这种方法是用亲水的溶剂(如尿素)和组织水合,使整体的折射率达到1.38-1.48的范围。第一个使用这个技术的是Scale法,这个方法使用在尿素介导的水合下使用去污剂去除样本里的脂质。具体的方法是长达几天或者数月的时间内将样本浸没在去污剂(如Triton™ X-100)中,同时用尿素渗透样本。这种方法能让组织的整体折射率降低到1.38的水平。利用甲酰胺的ClearT和使用较广泛的利用尿素和蔗糖的CUBIC也属于这种方法。CUBIC的优点在于操作简单,透明能力良好和利于荧光蛋白的保存。但是缺点在于需要花数个星期的时间来透明样本。些方法的应用在心脏形态发生过程中绘制祖细胞图谱(CUBIC法),研究大脑发育过程中的中间神经元(CUBIC法)和脑中的18-β淀粉样蛋白斑块可视化(ScaleS法)。

最后一种方法是水凝胶包埋法。前面所说的方法里,无论是用高浓度去污剂(Triton等)还是用刺激性溶剂(THF等)都会导致蛋白质大量流失。为了解决这个问题,CLARITY和PACT/PARS通过把组织嵌入了水凝胶来解决这个问题。在水凝胶包埋之后,通过去污剂(8%SDS)孵育或者电泳在不流失蛋白质的情况下将脂质快速去除。在去除脂质后,将其浸入基于碘海醇(Histodenz)的RIMs溶液中平衡折射率,TDE和80%甘油也可以起到同样作用。这个方法的优点在于优良的透明能力,并且可以与蛋白质的荧光基团相容。但是它的透明速度较慢,需要更多的设备来实行,并且最佳的RIMs需要用到的碘海醇,上文已经说了,价格比较昂贵。这个方法的应用范围很广,可以用来绘制全脑活动和神经投影图(CLARITY),可视化整个肺部深处的结核分枝杆菌感染(PACT),甚至可以用于清除骨骼(PACT-deCAL) 。

  优点 缺点 包含的方法
有机溶剂法速度快(1d);
透明效果好
荧光不相容;
引起样本收缩;
需要特殊物镜
BABB;3DISCO;iDISCO;uDISCO
简单浸入法成本低;
步骤简单;
可以保留脂质
透明速度慢;
对大样本效果不好
FocusClear™ ; RIMs TDE ;FRUIT ;SeeDB2
超水合法操作简单;
透明能力良好;
荧光基团相容
透明速度慢 Scale; CUBIC
水凝胶法优良的透明能力;
荧光基团相容; 蛋白质流失少  
透明速度慢;
需要设备复杂; 价格可能较贵  
CLARITY;PACT;PARS

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