组织透明技术总结帖(3)——成像

上面谈了透明的方法,把组织透明之后,下一步就是成像了。

对透明组织成像主要有三种办法可以选择。共聚焦显微镜,双光子显微镜,光片显微镜。这三种显微镜根据原理不同成像的能力也不同。

谈这些显微镜之前首先要看一看传统的荧光显微镜(宽视场荧光显微镜)的局限。

宽视场荧光显微镜原理示意图

从这张示意图可以看出,荧光显微镜通过光源照射样品,激发的荧光经过物镜和目镜传入显微镜的光电检测器中。然而这样会产生的问题是,不只是光源焦点会激发荧光,而整个被照射的锥形区域都会被激发荧光(图中的emission light),这些荧光经过折射后同样会传入检测器中,从而对成像造成干扰。对于一定厚度的样品,聚焦平面上下平面都有荧光激发产生的干扰称为轴向干扰。邻近区域受到的干扰称为侧向干扰。

而共聚焦显微镜所做出的改进,就是在检测器前加了一个针孔,从而限制非焦平面的干扰光进入,能被检测器检测到光就只是一个点的光。再通过振动镜进行扫描,就能够成像一个二维乃至三维的图像。

共聚焦显微镜原理示意图

通过对光的限制,共聚焦就有了更高的分辨率(0.15微米),同时也具有了三维成像的能力(0.2微米)。但是,这对透明组织来说是远远不够的,同时,它也无法解决激发区域过大产生光漂白和光毒性的问题。

进一步的改进则是双光子显微镜。

双光子显微镜(右)与共聚焦显微镜(左)原理比较

双光子显微镜是利用近红外光激发。在高密度的情况下,两个光子的能量可以叠加起来,从而激发荧光。因为它每次只激发一个点,所以比共聚焦的优点在于减少了光漂白和光毒性的作用。同时,因为近红外光的波长大,它的穿透能力也比共聚焦高,所以成像深度也比较大(1mm)。

这两种显微镜的原理有相似之处。尽管双光子显微镜的成像深度要优于共聚焦显微镜,但是在实际运用中,因为共聚焦显微镜的效率较高,也更不容易在多种颜色的样品中交叉激发(cross-excitation),所以在成像过程中通常会有更高的信噪比。此外,因为激光线之间可以快速切换,所以可以更快获得多色的共聚焦图像。所以在实际工作中,更常采取共聚焦显微镜。但在成像没有完全透明的样品、需要避免光毒漂白和光毒性的样品、需要用近红外光激发紫外光的样品等情况下,采取双原子显微镜使更好的选择。

然而,对于透明组织,1mm的成像深度是远远不够的,而且越深的地方,这两种显微镜成像的质量就越差。此外,因为这两种显微镜都需要激光扫描,所以这会耗费很长的时间,如果要扫描整个小鼠大脑的话,需要将近50天的时间!所以,这两种显微镜适用于局部的小样本的成像。

而接下来要介绍的一种显微镜可以克服这些缺陷,也就是光片显微镜。所谓光片,也就是垂直于观察方向的光的薄片,它一般是通过柱状透镜生成的激光束,或者扫描的圆形光束产生。这个平面被照亮后,显微镜通过捕捉这个平面成像。

光片显微镜与宽视场荧光显微镜比较

因为成像是通过可以相对移动的光片,所以它基本消除了显微镜本身成像深度的限制。同样,因为它是整个平面同时被相机捕获,而非通过点扫描的方式,所以它的速度相对较快。对于光片显微镜的限制在于,它的轴向分辨率相对较低。这是因为用常规方法产生的光片较厚导致的。而其成像的技术也进行了相应改进。比如利用贝塞尔光束或点阵光片成像,可以达到数百纳米的分辨率;利用正交视图对样本进行双次成像,可以达到300-400nm的高分辨率。总之,利用计算机技术和自动化策略,可以使分辨率达到相对较高的水平。但是,成像的轴向分辨率和观察到的视野大小之间是需要权衡的。也就是说,视野越宽,轴向分辨率就越低;视野越窄,轴向分辨率就可以提高。所以,如果要对大视野进行高分辨率的成像,就要对样品采取切片策略(tilling strategy),再用计算机进行组合,这就要用到比较复杂的图像处理技术了。

以上介绍了三种不同的显微镜。不管是哪种显微镜,都需要注意要将物镜的折射率和透明的溶剂折射率相匹配,以避免球面像差。所谓球面像差,就是通过样本的光在经过盖玻片、空气等折射率不同的界面时发生折射,从而使成像模糊。许多通常使用的物镜时为暴露在空气(RI=1.0)或者浸没在水(RI=1.33)里设计的,而我们透明的溶剂折射率通常更高(RI=1.4·1.5),所以为了更好地成像,需要使用折射率相匹配的物镜。这可以通过订购针对特定折射率的物镜或者使用校正环实现。

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